现场样品采集、保存和运输

在现场调查中，很重要的一项工作是正确采集、妥善保存和尽快送检样品，以及随后对样品检测结果进行正确的判读和分析。科学合理地采集、保存和运送样品或标本，将直接影响检测结果的可靠性；正确判读和分析检测结果，将现场调查结果和实验室结果密切结合，有利于更科学合理地分析突发事件或疾病暴发流行的原因，以及进行正确的卫生质量评价。
(一)样品采集的目的、作用和原则
现场调查的目的主要可分为两大类：一是查明突发公共卫生事件或疾病暴发流行的原因，二是进行卫生质量监测和评价。为了达到现场调查的目的离不开实验室检测证据的支持，而获取实验室证据的首要前提是采集合理的样品。以查明突发公共卫生事件或疾病暴发流行的原因为目的的实验室检测，检测的对象主要是病原微生物和毒物，检测结果能够为临床确诊病例、合理治疗、查明暴发原因、追踪传染源：切断传播途径、制定有效预防控制措施提供依据；以卫生质量监测和评价为目的的检测，检测对象既有病原微生物和毒物，又有指示微生物和其他一些和产品质量相关的因子，检测结果是评价的依据；无论是什么目的，实验室检测的对象又分为生物性因子和非生物因子。根据样品来源不同，样品又可分为生物性样品(来源于人的后称临床样品)、环境样品、动物及媒介昆虫样本和产品样品等。尽管根据调查目的、检测对象和样品种类不同，采样具有其特殊性，但应该遵循如下总原则：
1．注意生物安全采样中避免造成人员感染、标本和环境的污染。采用防护装备，注意安全操作和安全包装样品。需要采取的具体措施包括如下两方面：①个人肪护：采样时要戴手套，接触不同患者时不能重复使用一副手套，以免交叉感染，并留意手套是否有小的破损；采样中尽可能穿防护服，根据所估计的疫情级别，选择不同的防护服；采样后消毒要穿戴防护服和厚橡胶手套，对污染区表面和溢出物进行消毒；如怀疑有高度传染力的病原，需使用护目镜、呼吸面罩等；为了防止意外，确保安全，采样应备有急救包，供意外泄露时应急使用。②恰当处理污染废弃物：污染的可废弃设备和材料应先消毒后废弃；用过的针头妥善收集消毒，并按规定销毁或损毁；在暴发疫点使用过的防护服、设备、材料等使用化学消毒剂消毒后再清洗，特殊情况也可在现场建简易焚烧炉焚烧。
2．注意采样的代表性或针对性-以卫生质量评价为目的的样品采集，影响采样代表性的因素包括采样量、采样部位、采样时间、采样的随机性和均匀性，以及按批号抽样。同时还应考虑原料情况(来源、种类、地区、季节等)、加工方法、运输、保藏条件、销售中的各个环节(例如有无防蝇、防污染、防蟑螂及防鼠等设备)及销售人员的责任心和卫生认识水平等对样品可能的影响。以查明突发公共卫生事件或疾病暴发流行的原因为目的的样品采集，不要求样品的代表性，强调针对性，尽可能采集病原微生物含量最多的部位和足够检测用的样本；根据疾病表现和流行病学调查资料，指导采集正确的样品。
3．注意采样时间和种类采样时间和种类是病原体检测中的重要影响因素。一般原则是根据不同疾病的特点和临床表现，确定采样时间和标本种类。以分离培养细菌为目的，则应尽量在急性发病期和使用抗生素之前采集标本，如果已使用抗生素，采样和分离培养最好加入相应的中和剂(中和样品中残存的抑菌物质)或进行其他处理，避免抗菌药物对细菌培养的干扰。作病毒分离和病毒抗原检测的标本，应在发病初期和急性期采样，最好在发病1～2天内采取，此时病毒在体内大量繁殖，检出率高。
4．注意避免采样引入新的污染或者对微生物的杀灭因子所有采样用具、容器需严格灭菌，并以无菌操作采样。对容器基本要求是选耐用材料制成，容器包装好后可防渗漏，能承受空中或地面运送过程中可能发生的温度和压力变化。对微生物样品，应避免采样时对微生物的杀灭作用和引入新的抑菌物质，如容器是否有消毒剂的残留，或使用刚烧灼未冷却的采样工具。并注意保护目的微生物，注意使用正确的采样液和加人中和剂。
5．注意对样品的详细标记用于卫生质量评价的样品，应标明样品名称、编号、采样时间、采样量、采样者、检测项目等。以查明突发公共卫生事件或疾病暴发流行的原因为目的的样品，往往不是单一类型的样品，可能包括患者的标本、环境或者食品样品，以及相关的媒介生物，因此标记需要更详细，如标明标本的种类、标本性质、数量、统一的惟一识别编号及患者姓名、检验目的、临床诊断等信息，以供检验者参考。实验室可能需要其他信息来解释一些结果，如患者信息(年龄、性别、详细地址)，临床资料(发病日期、临床症状、治疗史、可疑的发病原因、采样前是否用抗生素)，急性或恢复期标本，症状类似患者的其他标本。因此，在暴发调查中个案调查的信息应尽量详细，并且和标本同时收集，保证标本和信息之间的符合性。
(二)样品采集的方法和注意事项
调查目的、检测对象和样品类型不同，样品采集的方法各异。以卫生质量监测和评价为目的的调查，样品类型主要是环境样品和产品样品包括水、土壤、空气、物品食品、化妆品、涉水产品、消毒及卫生用品等，主要检测卫生微生物和卫生理化指标，采样时遵循上述总原则，特别注意采样的代表性，检测卫生理化指标的样品可以不进行无菌操作，但不能引入其他的化学因子。以查明突发公共卫生事件或疾病暴发流行的原因为目的的样本采集，样品类型除上述两类可以作为原因样品外，主要需要采集的生物性样本如各种体液样本、呼吸道样本、消化道样本：皮肤样本，以及尸解或活检的各种组织器官样本等，如有必要，还应进行媒介生物或相关动物样本，如各种宿主动物的血液样本、排泄物样本、尸解样本以及各种昆虫样本等。因此，下面将结合调查目的和检测对象，介绍不同类型样品的采集方法和注意事项。
1．用于微生物分离培养或抗原检测的生物性样品主要用于查明突发公共卫生事件或疾病暴发流行的原因。
(1)咽拭子、洗漱液或痰液标本：①咽拭子的采集：让患者仰头张口，用压舌板压舌，用无菌棉拭子在咽部涂抹数次后，放入含2mlHank液的试管中，棉拭子接触手的部分应及时折断或剪断去掉；然后盖紧试管。②洗漱液的采集：用生理盐水或自配淡盐水约1，5ml作为洗漱液，让患者咳嗽后，倒入灭菌生理盐水或自配淡盐水约15ml，反复洗漱咽部1分钟，直接将洗漱液吐入灭菌容器内。③痰液标本：肺部感染应采取痰标本，以清晨第一口痰为最佳。采取标本的时间一般在发病的第一日采集，最迟不得超过3日，最好选择体温在38℃以上时采集。
(2)粪便标本：对黏液脓血便应挑取黏液或脓血部分，液状粪便采集水样便或含絮状物的液状粪便2～5ml；成形粪便至少取蚕豆大小粪便1块(约5g)放于灭菌容器内，最好加有保存液或增菌液。若无法获得粪便时，可用保存液或增菌液湿润过的棉拭子插入肛门4～5cm深处(小儿2～3cm)轻轻转动一圈，取直肠表面的黏液后取出，盛入运送培养基或保存液中送检，为保证多个检验项目的开展，同一患者应至少采集2支肛拭。采样时注意勿将尿液或水混入粪便或容器内，采样后尽快塞紧或旋紧容器，所采取的粪便标本应尽快送检，运送时间不得超过2小时，否则应保存在4～8℃条件下送检；集体腹泻或食源性疾病暴发患者粪便采集，应根据患者人数决定采取标本的数量；尽量在急性腹泻期及用药前采集。
(3)血液标本：作血液病原培养时，严格无菌采静脉血，一般成人采血10～15ml，儿童2～5ml，婴儿0.5～2ml，放入无菌的加入抗凝剂的有螺日容器或培养瓶中送检。作血片、暗视野检查可采耳垂血或指尖血。
(4)尿液标本：主要采用中段尿采集法，先用肥皂水清洗外阴部，再以无菌水洗净，一般取首次晨尿的中段尿10～20ml于无菌容器内。结核分枝杆菌集菌检查时，以一清洁容器留取24小时尿，取沉渣10～15ml送检。注意无菌操作并在用药前采集，最好在2～3小时内送到实验室检测，否则应在4～8℃条件下保存运送样品。
(5)脑脊液：在无菌条件下由腰椎穿刺抽取3～5ml，放于无菌试管或厌氧瓶内(需厌氧培养时)。用于细菌培养时标本采集后应立即送检；用于病毒培养时在4～8℃最多可维持48小时，否则需在-70℃保存；本操作最好在医院内由有经验的医生按腰椎穿刺术进行。
(6)皮肤标本：有时需要采集皮疹或皮肤病变标本帮助诊断。如怀疑皮肤炭疽或淋巴腺鼠疫时可从病变皮肤(焦痂和腹股沟淋巴结)取样做细菌学培养。出现囊疱疹或脓疱疹时可直接从囊疱或脓疱采集液体用于镜检或培养。采集疱疹标本时要注意无菌操作，刺破疱囊后用无菌拭子尽量拭抹足够量的疱疹内液体。
(7)尸体标本：进行解剖和取样。解剖前观察并记录外观状态，如新鲜程度、皮肤粘膜、淋巴结i尸僵程度和自然孔有无血性渗出物等。剖开后应观察皮下有无出血，胶样水肿，淋巴结、肝、脾是否大和有无其他病变，肺部有无充血，肝样实变、化脓和结节性病灶等。如需要采血则需进行心脏穿刺。采脑组织样本时，如不开颅，可用穿刺长针由鼻孔插入，一直刺到脑干和间脑部位吸出脑组织少许。剖检森林脑炎尸体时，可采取丘脑和小脑部分，其他型别脑炎可采海马回部位的脑组织块。如取脏器组织，先用灼热的金属压舌板接触一下采样部位，瞬时烙焦表面，清除杂菌，用剪刀剪取深部组织块。供分离病毒的组织要在死后5小时内取样。尸体如已腐烂，可锯一段带骨髓的股骨送检。至少取1～2g感染部位标本，放入单独的装有相应液体或培养基的无菌容器中(注意贴牢标签和拧紧螺口)，这些液体如：用于组织病理学切片的固定液，用于制备免疫荧光显微技术所需的冷冻切片的无菌盐溶液，用于分离细菌或病毒所需的各种转运培养基。装样本的容器封口后，表面用碘酒涂擦消毒后送检。为了避免尸体和解剖时的污染物成为传染源，解剖后尸体最好火化；不能火化则应离村庄和交通要道1km以外，深挖2m以上土坑，坑内和尸体周围撒生石灰，先填人可能被污染的土，后用净土填平；所用器材和隔离衣，凡耐热者均煮沸消毒40分钟，橡胶和塑料制品用1％～5％含氯消毒剂浸泡6小时以上。
2．用于病原体抗体检测的标本通常包括血液和脑脊液。采集血清样本可将10ml静脉血移入无抗凝剂的无菌螺口管，室温静置30分钟使之凝集，然后置4～8℃至少1～2小时(在此温度下可存放48～72小时)，离心收集血清。如能立即检测，采集的血液应在室温下尽快分离血清。如用于微量法试验，可用三棱针刺手指或耳垂部，再用毛细管采集，一般不少于0．3ml。用于检测IgM的血清一般采于发病1个月内；用于检测IgG的血液应于发病初期(1～3天)和恢复期(第一次采血后3～4周)各采集1次。脑脊液采集方法同前所述，一般于出现神经症状时采集，查IgM需采1份脑脊液，而查IgG则需收集2次，采集时间如前所述。
3．环境样品可用于检测环境被污染的状况，并对其进行卫生学评价，也可作为食源性疾病，突发公共卫生事件的原因样本。：这里主要介绍空气、水、土壤样品的采集方法。
(1)空气样品：一般需要用空气采样器采集，用于检测微生物或化学因子，包括毒物。空气中细菌和真菌还可使用平板沉降法。空气采样器有不同的分类方法，种类繁多，如按流量的不同，采样器可分为大、中、小三类：≥500L／min为大流量，499～11L／min为中流量，≤10L／min为小流量；根据采样器所用介质性质可分为固体采样器和液体采样器；根据采样器的工作原理可分为撞击式、沉降式、过滤式、静电吸附式、旋风式和离心撞击式六种。无论是哪种采样器，使用时应特别注意采样器的效率和适应范围等因素：如撞击距离、物理参数、粒子大小范围、气溶胶浓度、风向、风速等，以及考虑采样因子的生物学特性，选择适当的采样条件。平板沉降法由于方法简单，不需要特殊设备，虽然准确性低于仪器法，但仍被广泛应用，采样方法是将琼脂平板置于各采样点，打开平皿盖，扣放于平皿旁，暴皿于规定时间后立即盖好盖送检；注意根据房间面积确定采样布点，室内面积<30㎡时，设内、中、外对角线3点，距墙壁1m，距地面高1．5m；>30㎡者，设4角及中央5点，距墙壁1m，采样高度距地面高1．5m处。
(2)水样：既可用作环境卫生质量评价，也可能是突发公共卫生事件的原因样品。水样来源主要是河水、湖水、地下水和自来水，在疫区还包括稻田、塘水、井水和邻近畜舍、厕所的积水点。采样器具有用于手工采样的采样瓶和自动采样器。手工采样是将水样瓶用铁架固定，塞住瓶口，待瓶沉入到一定深度时拉开瓶塞，让水样进入。自动采样是用自动采样器在一定间隔时间中或连续采集样品，分别放入样品瓶或合并于一个样品瓶中成为混合样。疫区传染病病原污染的上述水体，采集时最好采非日光直射处的表层水。采集自来水样品时，先用酒精灯将水龙头烧灼消毒，然后将龙头打开，放水5～10分钟，再采集水样。采样量因工作条件和样品处理方法不同而不同，如直接用于增菌可采250～1000ml；先作絮凝或离心浓缩处理时，以每个采样点取100～200ml为宜。生活饮用水样微生物检验的采集和盛装容器均须无菌，如水中有余氯，在容器灭菌前应向内加入硫代硫酸钠以还原余氯。用于化学因子检测的水样盛装容器可以不灭菌，但应彻底清洗干净。
(3)土壤样本：根据检测目的选择有代表性的土壤，确定采样地点。按对角交叉(五点法)取样；用灭菌工具先除去地表枯枝落叶，再铲除1cm左右表层土，以避免地面微生物与土样混杂；用烧灼过的勺或铲取土样约200～300g，装于灭菌容器内，并注意保留适当空间，混合后，标明采样地点、深度、日期后送检。
综上可见，样品类型很多，而不同微生物，需要采集的样品和采样要求各异，表2-5、表2-6


为主要法定报告传染病检验标本采集的相关要求，供参考。表2．5主要法定报告细菌性传染病检验标本采集相关要求表2-6主要法定报告病毒性及其他传染病检验标本采集相关要求
4．产品样本包括食品、化妆品、涉水产品、消毒及卫生用品等，主要用于卫生理化和卫生微生物指标检测，对其进行卫生学评价及产品效果评价。采样方法和采样量参照国家相关标准执行。特别注意采样量的要求，以保证采样的代表性，请参考相关国家标准。还应注意包装的完整性和抽样的随机性。
5．用于调查中毒的样品中毒的因子可分为化学性、生物性和物理性三类，中毒的途径主要有消化道和呼吸道，而中毒的表现也各种各样，如急性胃肠炎、呼吸道症状、神经系统症状或者全身多器官损坏等，因此调查中毒的样品既包括食品、水、空气和食品接触的相关人员的样品，又包括中毒者的呕吐物、排泄物、血液等临床标本，而中毒的原因样品往往只能一次性提供。这些因素导致对调查人员的要求更高，除了采用正确的采样方法外，还应在采样前充分了解事件发生的相关背景资料，进行综合分析，制定初步采样计划，明确采样的目的，带足采样工具和适当的容器进行采集，避免漏掉重要的样品，从而影响对中毒患者病因的诊断和治疗方案的确定。在中毒标本采集中，中毒人员临床标本采集方法与前面类似，但有一些特点，因此再分述如下：
(1)胃内容物：是确定中毒的最好样本之一。可以通过收集患者呕吐物、洗胃液、胃内抽取液和尸体解剖获得。在采集时要注意避免污染，洗胃液最好采集最初抽出的，用高锰酸钾洗胃后的胃液意义要小些。在收集尸检材料中的胃内容物时，要注意胃的底部胃液的收集，因为比重大、溶解度低的物质往往沉淀于底部，如毒鼠强。采集的胃内容物量较大时，可取出后倾倒入一较大的玻璃漏斗内，漏斗的出口先塞住，混杂在胃内容物中的结晶和粉末将沉淀在漏斗底部，然后将上层液体和下层固体分别收集。在尸检中，对中毒迁延一段时间后才死亡的患者或生前已经进行洗胃的患者，要注意收集肠内容物。胃内容物的收集时效性强，错过了时机不能弥补。所采集的样本可用玻璃、聚乙烯或聚四氟乙烯器皿盛装，避免使用金属器皿。采集量最好达到100g(ml)以上。
(2)血液：是确诊中毒最主要的样本，因为某些经常可能服用的药物，如镇静催眠药剂，胃内容物中查到不能确诊，只有从血中检测到超过中毒量及死亡量时才能够确定。血液采集方法同前，应注意：①根据不同毒物在血液中的半减期决定采样时机；②选择恰当的盛装血样的容器，如疑为百草枯中毒患者的血液不能用玻璃试管，因为玻璃可以使百草枯钝化，钝化后的百草枯实验室不能检出；③注意密封，如疑为一氧化碳中毒者应尽早抽血5～15ml装满玻璃试管，必须用密封玻璃塞塞紧，避免瓶中残留空气，血液是分析一氧化碳中毒的惟一检材；对于其他易从样本中逸出的毒物也要密封保存，尽快检测，如氰化物；④尽量不加防腐剂和抗凝剂。
(3)尿液：毒物常以原形或其代谢物的形式排泄，因此尿液也是毒物检测的重要样品。尿液可直接收集、导出或注射器抽取，无尿者也可取膀胱冲洗液。尿液一般每次采集100ml，用玻璃或塑料瓶盛装，不加防腐剂；注意采集时间，一些毒物在中毒初期尿检阴性，如百草枯一般要在口服后2小时采集。
(4)食物中毒的标本：中毒人员临床标本采集方法同微生物分离培养部分。其他食物中毒标本有：①可疑食品和水样，采样时将残余食物或水样用灭菌镊子或匙采取后置于灭菌容器中；体积较大的鱼、肉应在表面消毒后取内部检样；要注意取样量，通常50～200g。②从业人员相关标本可采集从业人员以及直接或间接接触食品有关人员的肛拭子，或化脓性疾病的病灶，方法同前，相关人员的手用棉拭涂擦采样。③食物中毒环境的标本：炊事用具如锅、碗、刀等用棉拭涂擦采样，抹布剪小片放入稀释液，菜墩用刀刮取表面后，将刮取物放入灭菌容器中送检。④其他：可疑有毒动植物样本要保持完整，最好能够收集到完整的个体或整株植物，可疑有毒的部位(如种子、花等)采集的量要充分；可疑的蘑菇在采集时要注意不要碰掉容易脱落的菌环等，尽量保持其完整形态，以利种类鉴定。
(三)样品的保存和运输
保存和运输用于检测病原体的样品与用于检测化学物质(包括化学毒物)的样品各有其特点。
1．检测病原体样品的保存原则是尽量保护待检微生物和注意生物安全。保护待检微生物可以从温度、湿度、营养、pH和抑制杂菌等方面考虑，可通过温度调节、加入保护剂和去除其他不利于待测微生物生存的因素来实现。一般低温可增加微生物的存活和抑制杂菌的过度生长，但某些微生物如淋病奈瑟菌等检验的样品，应放置在适宜的温度条件下运送。有的样品要使用运送培养基。分离病毒的组织块可放于50％甘油缓冲液中(pH8．0)，在5~C条件下保存数周，也可用由0．5％水解蛋白，2％小牛血清，青、链霉素各500U／ml，制霉菌素50U／ml组成的溶液保存。分离鼠疫菌等革兰染色阴性菌多用卡一布半固体培养基运送，用经1／15mol／LpH8．1磷酸盐缓冲液处理过的棉棒采样后，插入培养基的底部，拧紧管口螺旋盖运送；在此培养基中保存1周，不影响细菌的检出。怀疑厌氧菌感染或需要进行厌氧菌检验的检样，必要时应使用运送培养基，保持在厌氧条件下运送。分离培养细菌或病毒的标本，若在48小时内检测，保存于4℃；若在48小时后检测，保存于-70℃，但原则是尽快检测，分离病毒的组织块冻存，应该加入防冻剂如甘油。寄生虫样本的保存，每份粪便中加入10％福尔马林和PVA存于4℃。
2．化学因子或毒物样品的保存各类样本要分别盛装于容器中，包装固定，及时冷藏保存。多数毒物检验样本对保存的条件不是特别严格，需要特殊条件保存的样本要在标签上和清单中标明，同时将保存条件要求告知具体承办人员，并注意防止外泄。样本不要加防腐剂，若为防止腐败必须加用时，可加乙醇(化学纯)，并附一瓶所用乙醇样品作对照。福尔马林是用于固定样本以便病理检查，不能用于毒物鉴定分析的样本中。
3．含病原体样品的运送除了按照上述条件注意保护待检微生物外，样品运送应符合生物安全要求。必须遵循WHO对传染性物质和诊断性标本的安全运送指南(WHO，1997)。标准的包装方法和材料应能确保即使在运送中包装意外受损时也能保护人员的安全及标本的完整。因此运送标本时最安全的方式是用由三个包装层对包装物进行三层包装。原始的容器要求能防漏，可盛容量不大于500ml。在原始容器与第二层包装之间应放置足以吸附可能的漏液的吸附材料，并辅以第二层防漏包装。如果在-二个第二层包装中安放了几个易碎的原始容器，那么，这些容器应该进行独立包装或分开以防互相碰撞。第三层外包装必须符合标准，如果要空运，一个完整的包装其整个外部最小尺寸不能小于10cm，每个包装中标本量不超过4kg或4L(每个原始容器最大500ml)。每个包装标本中所含的感染物不应超过50g或50ml。运输标本的外包装必须有明确的标签，标明寄送人和接收人的详细联系方式、包装日期和运输日期等。附带的文件包含标本的详细资料(材料的种类、性质、数量、采样日期)，相应的生物危害标签及所需的保存温度。地面运送标本时注意将装有标本的箱子牢牢固定在交通工具上，车上还应备有吸水材料、消毒剂、手套、口罩、护目镜、密封防水的废弃物容器等防护用品。为避免路途颠簸引起标本溶血，可在运送前分离血清。在国际、国家、商业的有关规定允许情况下，诊断标本也可空运，应注意规范包装。
4．化学因子或毒物样品的运送用密封性良好材料进行包装，送检的样本要根据对温度、湿度的要求分类处理。大多数样本都可以常温下运送，对需要特殊条件运送的样本要专门标出，需要冷藏的可以根据冷藏温度和运送所需时间决定用冷藏箱、车载冷柜等方式。在运送过程中，要保证条件能够持续保障。运送毒性高的环境样本，除在保障运送途中完整外，要严防泄漏，污染环境，并应严格按照化学品管理的有关规定及时到公安部门备案。为防止在运输过程中的意外情况，要制定应急预案，对剧毒化学品要专人押运。
(四)样品检测结果的判读原则
样品检测结果与流行病学调查结果，以及临床表现相符时，得出调查结论或进行卫生质量评价并不难。但在很多情况下，检验结果可能不支持调查结果，因此需要调查人员综合分析，查找原因，对检测结果进行正确的判读，最后得出比较可靠的推论。对检测结果进行正确判读应注意如下几点：①流行病学调查资料的可靠性；②样品采集时间是否恰当，样品量是否足够用于检测，样品保存和运送条件是否恰当；③检验方法的灵敏度和特异性如何?应详细了解检测过程和结果，尽量得到原始数据或图谱，对有结论性质的报告，分析其合理性和可靠性。