40、关于碱裂解法提取质粒DNA的说法，正确的是 。A．加入无水乙醇可以沉淀浓缩质粒DNAB．溶液Ⅱ的作用是使DNA变性C．质粒DNA构象紧凑不会变性D．溶液Ⅲ的作用是使DNA复性

第1题：

第2题：

有关煮沸裂解法提取质粒DNA的正确叙述是（）

• A、该法是一种条件比较温和的物理方法
• B、煮沸能完全灭活核酸内酶A
• C、不适用于大多数Ecoli菌株
• D、适用于HB101菌株
• E、适用于<15kb的质粒DNA制备

正确答案:E

第3题：

试述举2种质粒DNA提取的方法及应用。

正确答案: 质粒DNA提取的方法包括碱裂解法、煮沸裂解法和SDS裂解法。
碱裂解法：在NaOH存在的强碱性（pH12.0～14.0）的条件下，用强阳离子去垢剂SDS破坏细胞壁和裂解细胞，并使宿主细胞的蛋白质与染色体DNA发生变性，释放出质粒DNA。它是一种适用范围很广的方法，能从所有的大肠杆菌（E.coli）菌株中分离出质粒DNA，制备量可大可小。
煮沸裂解法：是将细菌悬浮于含Triton X-100和溶菌酶的缓冲液中，Triton X-100和溶菌酶能破坏细胞壁，再用沸水浴裂解细胞，使宿主细胞的蛋白质与染色体DNA发生变性。对CCC质粒DNA因结构紧密不会解链，当温度下降后，CCC质粒DNA可重新回复其超螺旋结构，通过离心去除变性的蛋白质和染色体DNA，然后回收上清液中的质粒DNA。本法只能用于小质粒DNA（小于15kb）的小量或大量制备，适用于大多数从大肠杆菌（E.coli）菌株中分离出质粒DNA。
S.DS裂解法：它是将细菌悬浮于等渗的蔗糖溶液中，用溶菌酶和EDTA处理以破坏细胞壁，再用SDS裂解去壁细菌，从而温和地释放出质粒DNA到等渗溶液中，然后用酚/氯仿抽提。适用于大质粒DNA的提取。

第4题：

碱裂解法制备质粒DNA的方法有哪些？

正确答案: （1）接种菌落于含抗生素的LB中，37℃剧烈振荡反应；
（2）培养液4℃12000rpm30min离心；
（3）重悬细菌于100μl冰预冷的溶液I（50mM葡萄糖25mMTris-HCL（pH8.0），10mMEDTAPh8.0）中剧烈振荡；（4）加200μl亲配制液溶液II（0.2MNaOH1%SDS），混合内容物，不要振荡，置冰上；
（5）加150μl冰预冷溶液III（5MKac60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml），温和振荡10s置于阔步3-5min；
（6）40℃。12000rpm离心5min，转移上清；
（7）上清加等量酚；氯仿抽提，4℃，12000rpm离心2min，收集上清；
（8）加入2倍体积乙醇，振荡混合，室温放置2min；
（9）4℃，12000rpm，离心5min，弃上清；
（10）倒置离心管，倾干液体；
（11）1ml70%乙醇4℃洗涤沉淀，弃上清，空气中干燥10min；
（12）用500μl含无DNA酶的胰RNA酶（20μg/ml）的TE重新溶解核酸，振荡，贮于-20℃。

第5题：

碱裂解法提取质粒DNA的原理，分析影响试验结果的各种可能因素。

正确答案: 碱裂解法原理：在碱性条件下，双连DNA氢键断裂，结构破坏变性，环状超螺旋质粒不充分变性。在中性条件下变性质粒恢复原来构型，而线性大分子细菌DNA不能复性呈不溶物而经离心除去。
（各种可能因素是上一届的，具体其实大家可以根据那天师兄说的去写）
提取失败：
1）洗去双链时，将质粒DNA洗去；
2）破壁失败，质粒没析出；
3）加剂问题
电泳失败：1）电压太高
2）没加染色剂
3）胶穿孔
4）电泳时间过长

第6题：

小批量碱变性提取质粒DNA的原理与基本过程如何？

正确答案: 碱变性法是常用的质粒抽提方法，其原理是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
小批量碱变性提取质粒DNA的基本过程为——
（1）酶或机械法等方法破坏细胞，释放出胞内物质；
（2）加碱使DNA与蛋白质变性，加中和液复性。因为质粒DNA分子量小易复性，从而使得其与基因组DNA分离；
（3）在上清液中通过酚－氯仿抽提、去垢剂或酶使剩余蛋白质变性或水解，除去蛋白质；
（4）再加入醇溶液使质粒DNA变性沉淀而与其他水溶性物质分离；
（5）将沉淀溶解于有RNase的TE溶液中，温育降解RNA后电泳检测、-20℃保存。

第7题：

下列对细菌质粒生物学特性叙述正确的是（）

• A、质粒DNA复制为自主复制
• B、质粒DNA复制为非自主复制
• C、具有相容性
• D、细菌内结构相似质粒相对稳定
• E、质粒DNA不能复制

正确答案:A

第8题：

质粒DNA提取后如何检测其提取质量？

正确答案:质粒DNA鉴定常用琼脂糖凝胶电泳法。它是利用琼脂糖溶化再凝固后能形成带有一定孔隙的固体基质的特性，其孔隙大小取决于琼脂糖的浓度。在电场的作用下及中性pH的缓冲条件下带负电的核酸分子就可以向阳极迁移。不同DNA，其分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA主要是利用分子筛效应，其迁移速度与分子量的对数值成反比关系。此外，琼脂糖凝胶的浓度也会影响特定大小的线状DNA的迁移率，因此采用不同浓度的凝胶可以分离不同大小范围的DNA片段。染料溴化乙锭（EB）能够插入DNA分子中的碱基对之间而与DNA形成复合物，在紫外光的照射下发射荧光，且其发射的荧光强度与DNA的含量成正比。用肉眼观察，可以检测10ng以上的DNA。质粒DNA有三种构型，其中超螺旋的电泳迁移率最快。
质粒DNA的浓度测定主要有紫外光谱分析法与EB荧光分析法两种。其中紫外光谱分析法主要是根据DNA在260nm处有特异的紫外吸收峰，且其光吸收的强度与核酸的浓度成正比这一特性来推算DNA的浓度。据计算，测定该波长下DNA溶液的OD值，当OD260=1时，双链DNA含量约为50μg/ml，据此可计算出测定溶液中DNA的含量。由于蛋白质的吸收峰在280nm处，在测定DNA含量时，还常计算OD260/OD280之值，如该值为1.8—2.0时，认为已达到较高的纯度，如低于此值，表明其内含杂质较多，可能影响酶切反应。

第9题：

第10题：

第11题：

第12题：

第13题：

第14题：

目前使用较为广泛的质粒DNA小量提取的方法是（）

• A、牙签少量制备法
• B、小量一步提取法
• C、SDS裂解法
• D、碱裂解法
• E、煮沸裂解法

正确答案:D

第15题：

关于磷酸二酯键的说法正确的是（）

• A、只有目的基因中存在
• B、只有质粒分子中存在
• C、DNA单链或双链分子都存在
• D、只存在于双链DNA分子中

正确答案:C

第16题：

简述质粒DNA的分离提取方法。

正确答案: （1）选择性抽提法，（2）碱性SDS法

第17题：

碱裂解法提取质粒所用到的溶液I中的葡萄糖的作用是维持渗透压。

正确答案:正确

第18题：

关于碱解法分离质粒DNA，下面哪一种说法不正确？（）

• A、溶液I的作用是悬浮菌体
• B、溶液Ⅱ的作用是使DNA变性
• C、溶液Ⅲ的作用是使DNA复性
• D、质粒DNA分子小，所以没有变性，染色体变性后不能复性

正确答案:D

第19题：

简述快速氯化铯密度梯度离心法提取分离大质粒DNA的原理。

正确答案: 用氯化铯密度梯度离心分离核酸时，在高浓度氯化铯溶液中和溴化乙锭（EB.过量的情况下，EB-DNA络合物的浮力密度发生改变，改变的大小与EB结合量成反比。因此，用氯化铯密度梯度超速离心法，可分离双链RNA和单链RNA。也可分离共价闭合环状DNA与线形或带缺口的环状DNA。同时，EB-DNA络合物在紫外光下能产生荧光，可见到离心后形成的区带，便于收集DNA，所得的EB-DNA络合物用异戊醇抽提去EB，即可回收所需的DNA。此法得到的DNA纯度很高。

第20题：

第21题：

第22题：

第23题：

第24题：